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微生物的純培養(yǎng)步驟范文第1篇

關(guān)鍵詞：微生物學(xué)；實驗教學(xué)；改革

隨著現(xiàn)代生命科學(xué)的迅猛發(fā)展，對生物學(xué)專業(yè)學(xué)生的需求在日益增加。與之相適應(yīng)，許多高等院校都相繼設(shè)立了生物技術(shù)、生物工程、生物制藥等相關(guān)專業(yè)。微生物學(xué)是生命科學(xué)中各專業(yè)重要的專業(yè)基礎(chǔ)課。如何進行微生物學(xué)實驗課教學(xué)改革，是廣大微生物學(xué)教育工作者面臨的新課題。

由于微生物學(xué)內(nèi)容豐富，涉及面廣，實踐性強，傳統(tǒng)的實驗課程教學(xué)體系已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足學(xué)生今后的發(fā)展。在微生物實驗教學(xué)中，我們發(fā)現(xiàn)雖然在詳細(xì)講解后進行操作演示，但學(xué)生對標(biāo)準(zhǔn)的操作要領(lǐng)并不能很快掌握，以至于在實驗過程中還是犯同樣的習(xí)慣性錯誤。學(xué)生不能很好的掌握實驗過程中的具體和關(guān)鍵性的標(biāo)準(zhǔn)操作，不能很好的鍛煉學(xué)生的動手能力和創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。因此，加大實驗教學(xué)力度，強化實踐教學(xué)環(huán)節(jié)等方面的改革勢在必行。實驗教學(xué)課件可以實現(xiàn)實驗過程中的一些細(xì)節(jié)表現(xiàn)。學(xué)生可以根據(jù)自己的情況有選擇的學(xué)習(xí)或?qū)﹄y點、重點反復(fù)的觀看和學(xué)習(xí)。課件操作方便，使用多媒體技術(shù)即可自動演示實驗過程，可以加強學(xué)生對實驗操作的認(rèn)識和思考，提高實驗教學(xué)的質(zhì)量。調(diào)整和增加新的實驗項目將一些獨立的知識點貫穿起來，既能增加學(xué)生的學(xué)習(xí)效率，又利于對大學(xué)生綜合素質(zhì)的培養(yǎng)與提高，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

一、擴充和改進微生物實驗項目，調(diào)整驗證性和綜合性實驗項目的比例

為了培養(yǎng)學(xué)生的綜合實驗?zāi)芰蛯W(xué)生的創(chuàng)新能力，體現(xiàn)微生物學(xué)實驗改革的科學(xué)性和實用性，經(jīng)過多年的摸索和實踐對已有實驗項目進行了調(diào)整和改進。新增加實驗項目2項：菌群生長動力學(xué)實驗和抗生素抗菌譜及抗生菌的抗藥性測定；調(diào)整實驗項目2個：① 實驗室環(huán)境和人體表面微生物的檢查。該部分是將“實驗室環(huán)境及人體表面微生物的檢查”這一實驗（6學(xué)時）進行延伸。調(diào)整后的內(nèi)容是以該實驗為主線，在達(dá)到上述目的的基礎(chǔ)上，再加上細(xì)菌的劃線分離、純培養(yǎng)及菌種保藏等內(nèi)容，從而讓學(xué)生較系統(tǒng)的學(xué)習(xí)培養(yǎng)基制備、高壓滅菌、無菌操作技術(shù)，細(xì)菌培養(yǎng)、劃線分離、純培養(yǎng)技術(shù)、通過菌落特征對細(xì)菌進行簡單分類以及菌種的保藏等知識和技能訓(xùn)練。另外，以該實驗為例子，給學(xué)生灌輸從環(huán)境中篩選菌種的方法步驟等。通過本部分的學(xué)習(xí)，學(xué)生能夠基本掌握微生物相關(guān)操作，建立無菌操作概念，了解菌種的篩選分離等基本知識，為以后的實驗準(zhǔn)備工作和研究型教學(xué)奠定基礎(chǔ)。② 將原來的“土壤微生物的分離和純化（8學(xué)時）”改為“土壤微生物的分離純化和鑒定（不限學(xué)時）”。調(diào)整后該部分內(nèi)容是讓學(xué)生以小組為單位對感興趣的課題進行文獻(xiàn)調(diào)研、實驗設(shè)計、實驗操作，篩選出自己感興趣的菌株并進行鑒定（包括分離株的菌落特征、菌種的形態(tài)、大小、染色特性、生理生化特性等，再結(jié)合伯杰氏手冊進行鑒定）和一定的應(yīng)用研究（如特殊降解性能），最后以科技論文的形式提交實驗報告，以及進一步延伸作為自己的學(xué)士學(xué)位論文選題研究。在實驗過程中，開放實驗室，學(xué)生可以充分利用課余時間，根據(jù)需要安排時間。

針對微生物實驗在內(nèi)容上的調(diào)整，我們設(shè)計了新的實驗教學(xué)結(jié)構(gòu)層次。將實驗重組為基礎(chǔ)、專業(yè)、研究性三個教學(xué)層次，各層次均由指導(dǎo)、自主、綜合、設(shè)計等由易到難、循序漸進、不同要求的實驗組成；以課程、課外，必做、選做，開放等多種形式開設(shè)；開放性實驗是在教師的指導(dǎo)下，學(xué)生獨立設(shè)計，獨立準(zhǔn)備和操作，從材料的準(zhǔn)備到實驗結(jié)束的全過程，都由學(xué)生獨立完成，完成較為完整和系統(tǒng)的實驗課題，使學(xué)生品嘗自己的研究成果。

二、標(biāo)準(zhǔn)化實驗操作光盤和實驗教學(xué)課件的制作

為滿足微生物學(xué)實驗課教學(xué)的需要，豐富教學(xué)手段，課程組組織以實驗操作經(jīng)驗豐富的教師為主，錄制了一套標(biāo)準(zhǔn)化實驗操作光盤，制作成教學(xué)課件（尤其是操作較為復(fù)雜，結(jié)果不易觀察的實驗，如：酵母菌的形態(tài)觀察、死活細(xì)胞的鑒別）。將實驗原理、實驗?zāi)康摹嶒炂鞑摹⒉僮鞑襟E、注意事項以及一些微生物形態(tài)與結(jié)構(gòu)以試聽形式展現(xiàn)給學(xué)生，這不僅增強了實驗操作演示的生動性，增加了教學(xué)的直觀性，而且還使學(xué)生能很快掌握操作要領(lǐng)，加強了記憶，從而提高了實驗教學(xué)水平。

三、改進實驗教學(xué)的考核評價體系

傳統(tǒng)的實驗考核的方式主要以實驗報告為主，針對這樣的考核方式，學(xué)生常出現(xiàn)相互之間抄襲，作業(yè)敷衍的現(xiàn)象，既不能反映學(xué)生實驗的真實水平，考核指標(biāo)也比較單一。針對這些問題，結(jié)合實驗教學(xué)的改革實際，我們重新制訂了實踐教學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)。首先加大了實驗成績在該課程總成績的中比例，由原來的10%提高到20%；成績構(gòu)成包括理論水平、實際操作技能和實驗報告三部分，將開放性實驗設(shè)計方案納入評分范圍，實驗進行過程中記錄平時成績，對實驗結(jié)果不做硬性要求，但可作為評分參考。

四、總結(jié)

實驗課大多為理論課的附屬課程，實驗成績往往作為理論課成績的參考或以很低的比例計入理論課成績，在一定程度上造成了學(xué)生輕視實驗學(xué)習(xí)和實驗?zāi)芰Φ呐囵B(yǎng)。微生物實驗課是生命科學(xué)所有本科專業(yè)的必修基礎(chǔ)課，每年有幾百名學(xué)生進入實驗室學(xué)習(xí)，對實驗項目的的調(diào)整可使眾多學(xué)生受益。目前調(diào)整的實驗項目和教學(xué)課件已經(jīng)用于實驗教學(xué)，效果很好。與以前相比，學(xué)生能夠更好地掌握微生物最基本的操作技能，了解微生物學(xué)的基本知識，加深對微生物知識的理解；學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣、創(chuàng)造性、積極性都被充分挖掘、調(diào)動起來，能夠主動地去了解日常生活中的微生物與我們?nèi)祟惖年P(guān)系，并且養(yǎng)成了良好的學(xué)習(xí)習(xí)慣，為今后的學(xué)習(xí)打下了堅實的基礎(chǔ)；學(xué)生能夠與別人很好的協(xié)調(diào)與合作，培養(yǎng)了他們的團隊精神。總之，通過項目調(diào)整提高了實驗教學(xué)質(zhì)量，培養(yǎng)了學(xué)生的綜合素質(zhì)。今后我們還將繼續(xù)進行改進，以期獲得最佳的教學(xué)模式，推動實驗教學(xué)的改革進程，使實驗課教學(xué)真正能夠達(dá)到應(yīng)有的效果。

參考文獻(xiàn)：

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微生物的純培養(yǎng)步驟范文第2篇

目前，電導(dǎo)率法和流氏細(xì)胞法是食品微生物快速檢測比較常用的兩種方法，其中以流氏細(xì)胞法為原理的儀器，由于投入成本貴，且部分產(chǎn)品的檢測結(jié)果為死細(xì)胞，活細(xì)胞總和，因此與國標(biāo)要求不符。而以電導(dǎo)率法為原理的儀器，因其投入適中、運行成本極低，所以已在中國的許多食品企業(yè)中廣泛運用。

電導(dǎo)率方法的檢測原理

微生物在生長過程中，將大分子的營養(yǎng)物質(zhì)如蛋白質(zhì)、糖類等降解成小分子的單糖或雙糖，并經(jīng)進一步代謝產(chǎn)生許多帶電小分子，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基電導(dǎo)率發(fā)生變化，電信號經(jīng)放大后顯示并記錄，檢測系統(tǒng)每10分鐘檢測一次電導(dǎo)率的變化。

電導(dǎo)率變化達(dá)到臨界值所需的時間TTD與樣品的初始菌數(shù)呈半對數(shù)線性關(guān)系，我們只要用標(biāo)準(zhǔn)方法(如平板法)為對照，積累一定的數(shù)據(jù)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。就可以達(dá)到快速定量檢測菌數(shù)的目的。

選擇微生物快速檢測系統(tǒng)的關(guān)鍵點

作為食品企業(yè)用戶，對于微生物檢測一般最關(guān)注的項目為：

1、檢測結(jié)果是否真實可靠。重現(xiàn)性如何，以及與國標(biāo)法的符合率是否高；

2、加量樣是否足夠大，按要求企業(yè)至少要能檢測出lcfu／mL(靈敏度高)，加樣量的大小決定了靈敏度的高低；

3、檢測速度是否快，檢測時間是否短以及操作步驟是否簡潔；

4、運行成本是否經(jīng)濟，企業(yè)對儀器的一次性投資很關(guān)注，但更關(guān)注日常運行成本。這方面關(guān)鍵是測量瓶是否可以重復(fù)使用?重復(fù)使用時是否方便可靠?

5、檢測方法是否具有權(quán)威性，該點主要是指國際上通過的認(rèn)證，或國內(nèi)是否有客戶基礎(chǔ)。

6、其它方面：如檢測的靈活性、操作界面的人性化、檢測項目是否齊全，培養(yǎng)溫度范圍如何等。

而目前全世界范圍內(nèi)做電導(dǎo)率檢測微生物儀器的生產(chǎn)廠家僅2家，而英國DWS公司是其中最專業(yè)的一家，無論從產(chǎn)品性能，技術(shù)參數(shù)及客戶的認(rèn)可程度來說，該公司生產(chǎn)的Rabit微生物快速檢測系統(tǒng)(以下簡稱Rabit)均是最適合中國國情的選擇之一。

DWS公司Rabit最突出的優(yōu)勢

DWS公司生產(chǎn)的Rabit是全球電化學(xué)微生物檢測領(lǐng)域最具權(quán)威的檢測儀器，無論在設(shè)計、應(yīng)用、靈敏度、靈活性、人性化角度，都充分考慮到客戶的需求，在各方面都有完美表現(xiàn)，具體如下：

運行成本：為適合第三世界國家對檢測成本的需要，Rabit使用的是可以高壓滅菌并重復(fù)使用3年以上的耐高溫塑料材質(zhì)的測量瓶，所以日常的運行成本主要是培養(yǎng)基的成本。以細(xì)菌總數(shù)為例，使用原廠的培養(yǎng)基，每個檢測的成本約1―2元人民幣，客戶還可以使用其它品牌的進口培養(yǎng)基，菌落總數(shù)檢測成本低到0.2元。

靈敏度：由于Rabit采用的是10mL測量瓶，取樣量1～5mL，與國標(biāo)檢測方法的取樣量一致。其中對于不含添加劑的純冷凍飲品，可直接取1mL溶解后的樣品至測量瓶，靈敏度為1cfu／mL；對于添加其它成份的冷凍飲品，可先將樣品稀釋10倍，再取1樣品至9mL培養(yǎng)基(或取5mL樣品至5mL雙料培養(yǎng)基)中，靈敏度為2-10cfu／mL。

雖然有些用戶認(rèn)為國標(biāo)要求是小于30000個／mL，但是作為企業(yè)來說，我們應(yīng)該控制得越低菌數(shù)越安全。即檢測方法越靈敏安全系數(shù)就越高，用高靈敏度檢測設(shè)備檢測通過的產(chǎn)品，即使運輸過程的冷鏈或終端出現(xiàn)某些問題，產(chǎn)生產(chǎn)品失效并導(dǎo)致人身健康損害的可能性就越小。

檢測速度快：檢測速度與樣品中微生物數(shù)量，樣品的加工保存方式、加樣量，培養(yǎng)條件，臨界點參數(shù)等密切相關(guān)。樣品菌數(shù)越高，出結(jié)果越快。常見微生物項目的檢測時間如下：

常規(guī)細(xì)菌總數(shù)最多24小時，大部分只需12小時左右。實際數(shù)據(jù)證明，大部分冷凍飲品可以在8～10小時內(nèi)出結(jié)果。

大腸菌群通常只需12小時左右。

霉菌及酵母總數(shù)最多48小時。

UHT產(chǎn)品商業(yè)無菌測試為48小時。即包括保溫24小時，上機檢測24小時。

致病菌初篩時間一般為24―48小時。

節(jié)省檢測時間：一個微生物要形成一個肉眼可見的菌落必須生長到108～109個，而用電導(dǎo)率測定方法，一個微生物生長到106～107個時，就可以明顯測量出電導(dǎo)率的變化。電導(dǎo)率法為動態(tài)方法，樣品中菌數(shù)越多，出結(jié)果越快。菌數(shù)較多的樣品，數(shù)小時即可出結(jié)果。檢測原料中微生物時的速度尤其快速。而傳統(tǒng)平板法為終點判斷法，不管樣品中菌數(shù)是多少，培養(yǎng)時間都需要2天。因此電導(dǎo)率方法更省時、更靈敏。

操作步驟簡單：當(dāng)曲線校正完成后，我們只需制備好培養(yǎng)基，將測量瓶滅菌好，加9mL培養(yǎng)基(或5mL雙料培養(yǎng)基)，直接取1-5樣品至測量瓶中，放入儀器，設(shè)定好參數(shù)即可。儀器24小時全天候工作，非常安全可靠。無需國標(biāo)法中所需的梯度稀釋用的生理鹽水、無需梯度稀釋、無需倒平板，無需人工計數(shù)，無需清洗一大堆玻璃器皿，節(jié)省大量人力物力。

權(quán)威性：英國DWS公司在歐洲和日本韓國享有盛譽，在歐洲幾個主要國家DWS的電導(dǎo)率方法都通過認(rèn)證，上升為標(biāo)準(zhǔn)方法，在我國，目前一些國際知名的食品和化妝品公司已經(jīng)購買此儀器投入使用，一些疾病預(yù)防控制中心、質(zhì)檢所和檢測中心也已經(jīng)采購這類儀器，并在著手制訂相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)。

檢測的靈活性：Rabit采用單樣品管獨立控制方式，某一個樣品完成檢測后，可隨時取出，10分鐘后放置下一個樣品管，非常機動方便。

檢測項目：Rabit由于采用了獨家專利技術(shù)，可進行直接電導(dǎo)率或間接電導(dǎo)率測試，為檢測常見的常規(guī)微生物項目和致病微生物提供了一個很好的解決方案。其常規(guī)微生物項目為：菌落總數(shù)。大腸菌群、腸桿菌，革蘭氏陰性菌、厭氧菌，產(chǎn)孢菌，酵母和霉菌總數(shù)；致病微生物項目為：沙門氏菌，其它致病菌項目可客戶自行開發(fā)。其每種項目均使用不同的培養(yǎng)基及不同參數(shù)。此外，RaNt還可以應(yīng)用于消毒劑，防腐劑的評估測試，挑戰(zhàn)實驗，配方優(yōu)化等方面。

操作界面的人性化：Rabit采用的是基于Windows界面的人性化操作界面，直觀地實量餅圖，反映樣品檢測的進展情況；數(shù)據(jù)可輸出至其它統(tǒng)計分析軟件進行分析。

其它特點：Rabit培養(yǎng)溫度可以在25～45℃之間進行調(diào)節(jié)；采用干熱加熱槽，每個模塊可放置32個樣品管，溫度精度達(dá)到±0.1℃；一套Rabit軟件可最多控制16臺主機，多達(dá)512個檢測。

微生物的純培養(yǎng)步驟范文第3篇

關(guān)鍵詞：微生物學(xué)實驗課程；多學(xué)科融合；教學(xué)改革；教學(xué)質(zhì)量；創(chuàng)新能力

中圖分類號：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）47-0108-03

微生物學(xué)是生物學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域中極為重要的基礎(chǔ)性學(xué)科，同時也是生物工程和生物技術(shù)專業(yè)的核心課程。由微生物學(xué)的發(fā)展史不難看出，該學(xué)科最重要的特征就是具有實驗性和實踐性，同時具有很強的應(yīng)用性。微生物學(xué)實驗教學(xué)既是對微生物基本理論的深化和鞏固，又是培養(yǎng)學(xué)生觀察能力、動手能力、分析問題和解決問題能力的最有效途徑，更是培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力、科學(xué)思維和提高對本專業(yè)學(xué)習(xí)興趣的重要手段。因此，在開設(shè)微生物學(xué)課程時，微生物學(xué)實驗也是既重要又十分必要的課程。我校的生物工程、釀酒專業(yè)和生物技術(shù)三門本科專業(yè)盡管分屬于工科、理科性質(zhì)，但均側(cè)重于培養(yǎng)本領(lǐng)域具有國際視野、創(chuàng)新思維和解決實際問題的高素質(zhì)人才。特別是我校“國家生命科學(xué)與技術(shù)人才培養(yǎng)基地”的人才培養(yǎng)目標(biāo)明確定位為“培養(yǎng)適合社會發(fā)展的具有創(chuàng)新精神、實踐能力和創(chuàng)業(yè)能力的新世紀(jì)高層次工業(yè)生物技術(shù)人才”。同時，微生物學(xué)是多個相關(guān)學(xué)科的聯(lián)系紐帶，特別是生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和發(fā)酵工藝學(xué)等本專業(yè)的學(xué)科平臺課程和專業(yè)核心課程，均依賴于微生物學(xué)科的支撐。同樣，微生物學(xué)和微生物實驗課程的知識體系、基本理論和前沿進展又離不開其他學(xué)科的支撐，因此，在學(xué)科交叉與知識融合的背景下，在本科課程設(shè)置和教學(xué)模式改革中，我們特別注重微生物學(xué)實驗教學(xué)的教學(xué)模式改革和實踐效果。

一、微生物學(xué)實驗課程的傳統(tǒng)教學(xué)模式及不足

微生物學(xué)實驗是微生物學(xué)的重要組成部分，也是微生物學(xué)教學(xué)的重要環(huán)節(jié)。從培養(yǎng)人才目標(biāo)上來看，微生物學(xué)實踐教學(xué)與微生物理論教學(xué)具有同等重要的地位，甚至更高。就我校生物工程專業(yè)，微生物學(xué)理論課程設(shè)定40學(xué)時，而實驗課程設(shè)定48學(xué)時，這也從一定程度上反映了實驗教學(xué)的重要性。傳統(tǒng)的實驗教學(xué)雖有區(qū)別，但總的來看多以單元操作實驗、結(jié)果驗證實驗為模塊進行課程設(shè)置，其出發(fā)點是以掌握基本實驗技能，加深基本概念和理論為目標(biāo)的。就其出發(fā)點來看，傳統(tǒng)的實驗教學(xué)設(shè)置課程體系是發(fā)揮了良好的效果。但是，對照培養(yǎng)高素質(zhì)、寬口徑和創(chuàng)新型生物工程人才的培養(yǎng)目標(biāo)來看，傳統(tǒng)的實驗教學(xué)仍有一些不足之處，概況起來有以下幾點。一是在主觀認(rèn)知上，認(rèn)為實驗課的目的是驗證課堂講授的理論內(nèi)容，常采用實驗課堂上教師單純講解示范，學(xué)生一味跟蹤模仿，造成了學(xué)生被動接受知識的效果。長此以往，實驗教學(xué)形式僵化，學(xué)生上課興趣降低，導(dǎo)致最終的教學(xué)效果很難達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。二是實驗教學(xué)內(nèi)容的設(shè)計上呈現(xiàn)點狀式、碎片化特征，驗證實驗過多，綜合型、設(shè)計型實驗環(huán)節(jié)較少。這種實驗內(nèi)容的設(shè)計優(yōu)點是強調(diào)對基礎(chǔ)實驗技術(shù)的掌握，但是很難充分激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新思維和探索未知世界的興趣。三是實驗安排上采取每周有實驗，理論課和實驗課并行的特征，導(dǎo)致一些連續(xù)性的實驗難以及時完成。這種實驗課程學(xué)時的安排布局看似合理，實則不符合微生物學(xué)實驗的基本規(guī)律，因為有些微生物學(xué)實驗需要半天、一天甚至更長時間才能完成，而零碎的時間打斷了實驗的節(jié)奏，導(dǎo)致不可預(yù)知的實驗結(jié)果，更為重要的是沒有給學(xué)生充分的時間去思考、分析和吸收消化所學(xué)知識，教學(xué)效果肯定大打折扣。為此，我們在吸收、總結(jié)傳統(tǒng)實驗教學(xué)精髓的基礎(chǔ)上，根據(jù)工科專業(yè)人才的培養(yǎng)特征，探討和嘗試了一些微生物學(xué)實驗課教學(xué)的新舉措。

二、微生物實驗教學(xué)改革的探索與實踐

1.微生物實驗課程的體系改革。傳統(tǒng)的微生物學(xué)實驗主要包含無菌技術(shù)、染色技術(shù)、純培養(yǎng)技術(shù)、顯微技術(shù)這四大技術(shù)。如前所述，一方面，這些實驗技術(shù)是基本的微生物學(xué)實驗操作，隨著生命科學(xué)特別是微生物學(xué)科的快速發(fā)展，僅僅開設(shè)這樣實驗內(nèi)容是跟不上學(xué)科發(fā)展的步伐的，因此微生物實驗教學(xué)體系結(jié)構(gòu)也要有相應(yīng)的改革和創(chuàng)新，必須體現(xiàn)新內(nèi)容、新技術(shù)、新方法和新進展。另一方面，實驗課程通常將這些實驗技術(shù)分散在相對獨立的實驗單元中，各單元之間缺乏方法和內(nèi)容的有機結(jié)合，形成割裂的教學(xué)效果，難以有效地培養(yǎng)學(xué)生完整的知識體系，融會貫通的理解能力。這種傳統(tǒng)的教學(xué)形式不利于創(chuàng)新型人才的培養(yǎng)。因此，我們在課程實驗教學(xué)環(huán)節(jié)，重構(gòu)課程實驗的教學(xué)內(nèi)容和課程體系，增加綜合和設(shè)計型實驗比重，進行基本技能和創(chuàng)新能力的交叉遞進式培養(yǎng)。

首先，通過單元操作技能訓(xùn)練，培養(yǎng)學(xué)生的基本實驗技能（即染色技術(shù)、顯微技術(shù)、無菌技術(shù)、純培養(yǎng)技術(shù)）和動手能力。本部分內(nèi)容主要包括細(xì)菌、放線菌、酵母和霉菌的形態(tài)學(xué)特征；微生物培養(yǎng)基的配制和接種；微生物培養(yǎng)基的配制與滅菌等。單元操作訓(xùn)練是認(rèn)識微生物、了解微生物的入門技能，也是開展微生物學(xué)研究和微生物工程必備基本技能。在開展單元實驗過程中，為提高學(xué)生的積極性和實驗興趣，首先結(jié)合教學(xué)錄像進行講解，在實驗的關(guān)鍵點設(shè)置思考題，在觀看錄像過程中，老師隨時就問題和學(xué)生互動，讓學(xué)生對實驗原理不僅要知其然，還要知其所以然。在問題設(shè)置上要能夠從細(xì)節(jié)入手，讓學(xué)生學(xué)會知識的交叉運用、思維方式的靈活拓展。如在進行培養(yǎng)基滅菌實驗中，首先設(shè)置問題1：常見的滅菌方式有哪些？其適用范圍和特點有哪些？根據(jù)所學(xué)理論知識和老師引導(dǎo)，學(xué)生很容易回答這個問題。接著，設(shè)置問題2：無菌操作時，超凈臺面和雙手表面如何殺菌？通過這個問題與接種操作技術(shù)結(jié)合起來。設(shè)置問題3：我們在消毒時為何用70%左右的酒精而不是用無水乙醇？通過這個將微生物學(xué)和生物化學(xué)兩個學(xué)科進行了有機交叉，實現(xiàn)了知識的融合。緊接著設(shè)置問題4：如果工程發(fā)酵罐中發(fā)現(xiàn)了噬菌體污染，如何消毒？這個問題將理論問題與發(fā)酵工程相結(jié)合，該問題要求學(xué)生既要掌握理論知識，也要熟悉發(fā)酵工業(yè)才能很好地進行回答。通過四個環(huán)環(huán)相扣的問題實現(xiàn)了知識的遷移、交叉和融合。其次是通過綜合實驗設(shè)計，強化學(xué)生基本實驗技能和微生物學(xué)基礎(chǔ)理論知識的應(yīng)用。在這一部分中，首先由教師將一系列獨立單元實驗設(shè)計成圍繞為解決某一模擬課題而展開的系列關(guān)聯(lián)的實驗環(huán)節(jié)，然后學(xué)生利用微生物理論知識結(jié)合基本實驗技能，在遵循微生物基本原理基礎(chǔ)上在一定范圍內(nèi)自主選擇實驗對象。讓學(xué)生學(xué)習(xí)和掌握相關(guān)的實驗技術(shù)和方法并學(xué)會對不同實驗結(jié)果進行分析比較。以自來水中大腸桿菌菌群檢測為例，利用微生物的生理生化實驗進行微生物的鑒定，并對照水質(zhì)檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)來安排實驗。在這個實驗過程中，不僅利用了微生物學(xué)基本實驗操作，而且還將大腸桿菌的形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征以及菌種鑒定等知識融合到實驗中。更為重要的是，讓學(xué)生直接認(rèn)識到微生物特別是大腸菌群在水質(zhì)監(jiān)測中作為指標(biāo)菌的重要應(yīng)用。再次，通過設(shè)計型實驗，提升學(xué)生利用微生物學(xué)理論和實驗技術(shù)開展工業(yè)微生物菌株選育的能力。在這一層次上采用學(xué)生自主設(shè)計、老師負(fù)責(zé)把關(guān)的開放式實驗教學(xué)模式，強化工程概念和實踐特征。學(xué)生通過完成前面兩個階段的實驗，對微生物基本理論和實驗技能有了較好的理解和掌握。在此基礎(chǔ)上，開放式的實驗教學(xué)按照自由組合分組、獨立設(shè)計實驗方案、協(xié)同完善內(nèi)容安排、時間分配，強調(diào)團隊合作的基本原則開展實驗。老師在整個過程中要起著引導(dǎo)、啟發(fā)作用。例如：以“從自然界中篩選產(chǎn)酸性淀粉酶（或有機酸）的芽孢細(xì)菌”研究課題開展實驗為例。學(xué)生需要完成如下工作：通過生境分析明確采樣地點；完成采樣并查找或自行設(shè)計快速檢出方法；進行富集和選擇培養(yǎng)；篩選獲得相對優(yōu)良的產(chǎn)生菌株；初步鑒定和發(fā)酵實驗。整個環(huán)節(jié)的完成不僅可以提高學(xué)生對實驗課的學(xué)習(xí)興趣，強化團隊協(xié)作能力，更重要的是使他們獲得一個真實的實驗研究過程的鍛煉。最后，設(shè)置交叉學(xué)科的創(chuàng)新課題，引導(dǎo)學(xué)有余力的同學(xué)積極參與授課老師的相關(guān)科研課題，激發(fā)學(xué)生對生物工程和生命科學(xué)的興趣。如前所述，微生物與分子生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科有著廣泛的交叉與聯(lián)系，當(dāng)今工業(yè)微生物育種技術(shù)在多學(xué)科交叉融合的發(fā)展趨勢下取得了長足的進步。因此，培養(yǎng)創(chuàng)新潛力大、科研素質(zhì)高的學(xué)生，普通的實驗設(shè)計難以滿足需要。我們在不斷的探索過程中，初步形成了創(chuàng)新課題的形式，讓部分學(xué)生真正參與到科學(xué)研究的第一線。創(chuàng)新課題實驗按照學(xué)科交叉、由易到難、注重創(chuàng)新的原則設(shè)置。在學(xué)生能夠獨立完成小型課題的基礎(chǔ)上，再進一步融入到研究生課題的探索中。如，以“表達(dá)綠色熒光蛋白的重組大腸桿菌構(gòu)建”為課題，將微生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、基因工程、生物信息學(xué)等相關(guān)學(xué)科知識交叉、融合其中，讓學(xué)生在探索中創(chuàng)新，在創(chuàng)新中實現(xiàn)寬口徑、厚基礎(chǔ)型的人才培養(yǎng)目標(biāo)。

2.微生物實驗課程的課時安排和考核模式改革。如前所述，傳統(tǒng)的實驗教學(xué)課時安排導(dǎo)致不適宜于微生物實驗課程的開展。為了避免分散的課時導(dǎo)致教學(xué)效果的降低，教務(wù)部門在安排班級教學(xué)任務(wù)時，會統(tǒng)籌考慮不同課程的差異性，在協(xié)調(diào)優(yōu)化課時安排的基礎(chǔ)上，排出相對完整的時間安排微生物實驗課程教學(xué)。另外，任課教師統(tǒng)籌利用下午和晚上連續(xù)較長的時間開展教學(xué)工作。實踐證明，優(yōu)化課程學(xué)時結(jié)構(gòu)，合理安排教學(xué)課時能夠保障實驗的連貫性、一致性，提高學(xué)生的積極性，從而顯著提升教學(xué)效果。考核是實驗教學(xué)體系的重要環(huán)節(jié)，是評估學(xué)生學(xué)習(xí)成效的重要手段。傳統(tǒng)微生物學(xué)實驗考核方式相對單一，通常以實驗報告為主，考勤情況等為輔綜合評定的方法作為考核手段。這種評價方法盡管具有標(biāo)準(zhǔn)公平、成績公正、易于操作等優(yōu)點，不足之處在于導(dǎo)致學(xué)生僅注重實驗結(jié)果和實驗報告的書寫，而忽視了實驗過程中發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題能力的培養(yǎng)，更重要的是這種考核模式難以真實反映學(xué)生對微生物學(xué)理論和實驗技能的綜合分析能力和創(chuàng)新能力。因此，我們也對微生物學(xué)實驗課程考核方法進行了一些探索和嘗試。

首先，我們認(rèn)為考核的內(nèi)容不僅應(yīng)包括對實驗原理的理解和基本實驗技能的掌握，還應(yīng)包括分析和解決問題的能力、團隊協(xié)作精神以及科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度。因此，實行實驗過程與結(jié)果并重的考評方法對于培養(yǎng)學(xué)生良好的實驗技能和求真務(wù)實的科學(xué)態(tài)度很有必要。

其次，在加強對實驗課程的管理和考核規(guī)范的前提下，淡化和簡化實驗報告中操作步驟按部就班的抄寫，注重結(jié)果分析和討論，并在實驗結(jié)束后布置一些開放性的思考題讓學(xué)生完成。這樣，不僅能促使學(xué)生通過查閱資料解決問題，增強其學(xué)習(xí)主動性和分析問題的能力，也能避免學(xué)生對實驗結(jié)果作假和抄襲實驗報告的現(xiàn)象發(fā)生。

再次，分類考核，全面考查。對于一次實驗課能夠完成的單元操作實驗，指導(dǎo)教師應(yīng)當(dāng)場檢查學(xué)生的實驗完成情況和結(jié)果，發(fā)現(xiàn)問題當(dāng)場指出并評定課堂表現(xiàn)成績。教師將根據(jù)實驗課堂表現(xiàn)和實驗報告完成情況，對每個單元實驗的綜合成績進行評分。對于需要多次實驗才能完成的綜合性和設(shè)計性實驗，要求提供詳細(xì)的原始記錄、實驗結(jié)果分析報告作為實驗成績考核的重要依據(jù)。

三、結(jié)語

江南大學(xué)生物工程學(xué)院的微生物學(xué)理論教學(xué)和實驗教學(xué)在多年來不斷探索和改革的過程中，逐漸形成了具有特色的學(xué)科平臺課程。在教學(xué)過程中，微生物學(xué)理論課老師一般都要擔(dān)任微生物學(xué)實驗教學(xué)課程，這樣老師能夠更好地自主協(xié)調(diào)和平衡理論教學(xué)與實驗課程在時間、節(jié)奏和進度上的合理安排，從而使二者能夠相輔相成，相得益彰，整體上提高微生物學(xué)的教學(xué)水平和質(zhì)量。通過單元操作實驗、綜合實驗、設(shè)計實驗和創(chuàng)新實驗等由易到難、由淺入深的實驗內(nèi)容結(jié)構(gòu)安排，對學(xué)生更好地理解和消化理論課，培養(yǎng)學(xué)生動手能力、創(chuàng)新能力有重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

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[2]周宜君，劉越，戴景峰，等.微生物學(xué)實驗教學(xué)改革探索與實踐[J].微生物學(xué)通報，2009，36（10）：1609-1613.

微生物的純培養(yǎng)步驟范文第4篇

關(guān)鍵詞：生物強化技術(shù) 廢水治理 應(yīng)用

前言

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，廢水的成分日益復(fù)雜，尤其當(dāng)廢水中含有有毒、難降解的有機污染物時，由于對該類有機物具有專項降解能力的微生物在環(huán)境中的種類、數(shù)量較少，同時它在競爭中處于劣勢，因此，傳統(tǒng)的生物處理技術(shù)面臨極大挑戰(zhàn)。如果在傳統(tǒng)的生物處理體系中投加具有特定功能的微生物或某些基質(zhì)，增強它對特定污染物的降解能力，從而改善整個污水處理體系的處理效果，我們稱這種技術(shù)為生物強化技術(shù)。

一、生物制劑的優(yōu)點

生物強化制劑具有很多優(yōu)點：

1、它能縮短微生物培養(yǎng)馴化的時間，迅速提高生物處理系統(tǒng)中微生物的濃度，從而提高工作效率；

2、生物制劑所含天然微生物，不含致病菌和病源體，這些微生物在酶的催化作用下，以污水中的有機營養(yǎng)物質(zhì)為食物，當(dāng)污水得到凈化后，這些微生物會隨著污染物的降低而逐漸減少，直至消亡，不會造成二次污染；

3、使用安全，操作簡單方便，基本不需要添加設(shè)備或者工程，節(jié)省能源，節(jié)省資金投入。

二、生物強化技術(shù)的作用機理

生物強化技術(shù)， 就是為了提高廢水處理系統(tǒng)的處理能力， 而向該系統(tǒng)中投加從自然界中篩選的優(yōu)勢菌種或通過基因組合技術(shù)產(chǎn)生的高效菌種， 以去除某一種或某一類有害物質(zhì)的方法。它是通過向自然菌群中投加具有特殊作用的微生物來增強生物量， 以強化生物量對某一特定環(huán)境或特殊污染物的反應(yīng)。投入的菌種與底質(zhì)之間的作用主要有：

1、直接作用

就是通過馴化、篩選、誘變、基因重組等技術(shù)得到一 株以目標(biāo)降解物質(zhì)為主要碳源和能源的微生物， 向處理系統(tǒng)中投入一定量的該菌種， 就會達(dá)到對目標(biāo)去除物去除效果的增強作用。

2、共代謝作用

就是對于一些有毒有害物質(zhì)， 微生物不能以其為碳源和能源生長， 但在其他基質(zhì)存在下能夠改變這種有害物的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其降解。如在甲烷、芳香烴、氨、異戊二烯和丙烯為主要基質(zhì)生長的一些菌可以產(chǎn)生一種氧合酶， 這種酶可以共代謝三氯乙烯（ T CE） ， 但共代謝機制成功地用在生物增強系統(tǒng)中的例子并不多見。

三、生物強化技術(shù)的實現(xiàn)

生物強化技術(shù)在水污染治理中的有效實施需要三個步驟：首先是高效菌種的培育：其次是高效菌種在投加系統(tǒng)中的生長及活力表現(xiàn)：最終結(jié)果是對目標(biāo)物的有效去除或原系統(tǒng)某一特定性能的改善。

1、從自然界篩選菌種

從自然界篩選菌種的過程多數(shù)是以目標(biāo)物為惟一基質(zhì)來馴化、分離后得到的菌種，而實際廢水水質(zhì)狀況一般比較復(fù)雜，含有多種成分，因此將其投加到系統(tǒng)后可能受到其他組分的抑制作用，難以達(dá)到預(yù)期的治理目標(biāo)。為此，Babcock等開發(fā)了一種離線富集反應(yīng)器（off―line enriching-reactor）。這種反應(yīng)器可為生物強化技術(shù)的實施提供大量菌劑，并模擬實際廢水的組成和環(huán)境條件，使投加到系統(tǒng)中的菌種很快適應(yīng)新環(huán)境，從而有效去除目標(biāo)物。研究認(rèn)為，通過投加與目標(biāo)物類似的營養(yǎng)物質(zhì)可以達(dá)到富集培養(yǎng)的目的。通過研究還發(fā)現(xiàn)，用純菌Pseudomonas sp降解1-硝基苯酚，葡萄糖的存在會提高1-硝基苯與最大比基質(zhì)的去除速率，但此法并不適用于所有的微生物。例如，利用3～4種假單胞屬的優(yōu)勢菌種進行2，4-二氯苯氧乙酸與葡萄糖的共基質(zhì)實驗，2，4-D的降解速率不受葡萄糖是否存在的影響。對于那些對目標(biāo)物的降解需要誘導(dǎo)酶的微生物，可通過投加基質(zhì)類似物、中間代謝物等作為酶的誘導(dǎo)物，這些物質(zhì)一般能夠產(chǎn)生廣譜的親和性酶，且能夠保持高效菌種的降解性并促進其生長。

2、構(gòu)建基因工程茵

基因工程技術(shù)的發(fā)展為人類快速獲取一些高效菌種提供了新方法。利用降解性質(zhì)粒的相容性，把能夠降解不同有害物質(zhì)的質(zhì)粒組合到一個菌種中，組建一個多質(zhì)粒的新菌種，便能使一種微生物降解多種污染物或完成多個環(huán)節(jié)的降解過程，并使不帶降解性的菌獲得降解性。另外，可采用質(zhì)粒分子育種，即選擇壓力條件下，在恒化器內(nèi)混合培養(yǎng)，使微生物發(fā)生質(zhì)粒相互作用和傳遞，縮短了自然進化所需時間，以達(dá)到快速培養(yǎng)新菌種的目的。

3、水平基因轉(zhuǎn)移

高效基因工程菌屬于外源菌種，在與土著菌種的生存競爭中常處于劣勢，不能維持一定的生存數(shù)量和比率，因此一直是困擾這項研究順利進行的首要問題。由此大量研究集中在利用基因的自然水平轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)系統(tǒng)的生物強化上。其主要思路是將位于自由基因元素上的降解基因引入待處理污染物系統(tǒng)，通過自由基因向土著菌種的擴散和轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)已有菌種對污染物的原位基因修復(fù)。與傳統(tǒng)的生物強化方法相比，水平基因轉(zhuǎn)移方法由于降解基因處于一種自由的狀態(tài)，因此具有如下潛在優(yōu)點：

（1）含有降解基因的菌種加入到原始系統(tǒng)后，降解基因通過自由的水平轉(zhuǎn)移進入原有系統(tǒng)的固有菌中，由于新菌對環(huán)境有更好的適應(yīng)性，且轉(zhuǎn)移過程是自然發(fā)生的，因此降解基因在菌種內(nèi)也會更好地生存；

（2）在持續(xù)高效降解目標(biāo)污染物的同時，不需要特意維持含有降解基因的菌種在系統(tǒng)中的存活率。

四、生物強化技術(shù)的應(yīng)用

1、焦化廢水處理

焦化廢水中污染物組成復(fù)雜，含有十幾種無機物和有機物，有機物包括酚類、芳香族化合物以及含氮、硫、氧的雜環(huán)化合物，屬較難生物降解的高濃度有機工業(yè)廢水，國內(nèi)外研究者現(xiàn)在主要是通過投加高效菌種和化學(xué)試劑來提高現(xiàn)有處理設(shè)施的處理效率。固定化高效降解微生物的生物強化技術(shù)在焦化廢水處理中也有成功的應(yīng)用。通過利用喹啉為惟一碳源，馴化得到處理焦化廢水的高效菌種，并使其一部分附著在陶粒載體上處理焦化廢水，取得了很高的去除率。

2、印染廢水處理

印染廢水中含有大量難降解的有機染料，傳統(tǒng)的好氧生物膜法去除效果不理想。利用高效脫色菌、聚乙烯醇（PVC）降解菌以及活性污泥接種厭氧一好氧系統(tǒng)，結(jié)果表明，利用高效脫色菌和PVA降解菌接種厭氧一好氧處理系統(tǒng)處理印染廢水時生物膜形成快，去除效率高且穩(wěn)定，厭氧反應(yīng)器對色度的去除率比活性污泥接種高12.5%。

3、垃圾滲濾液

通過EM（efective microorganisms）菌劑培養(yǎng)生物膜和活性污泥來處理滲濾液，結(jié)果表明，EM菌劑可明顯提高對COD、BOD的去除率，能夠加快處理設(shè)施啟動速度，重新掛膜速度較快，系統(tǒng)的穩(wěn)定性也有所增強。

結(jié)束語

總之，生物制劑對于處理城市生活污水和天然水體的污染有其獨特的優(yōu)勢，但是，天然水體中污染物濃度相對較低，如何讓細(xì)菌適應(yīng)新的環(huán)境，而且在降解污染物的過程中，沒有有毒的中間產(chǎn)物生成，這些是其是否得到廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

參考文獻(xiàn)

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[2] 李景全，肖盟，石步乾，蘇全，楊彬，李國良，趙世玉，唐雪冰，張忠智. 生物強化技術(shù)在油田污水處理工程中的應(yīng)用[J]. 油田化學(xué). 2011（03）

微生物的純培養(yǎng)步驟范文第5篇

【關(guān)鍵詞】生物表面活性劑；鼠李糖脂；污水；修復(fù)

1、前言

隨著人們的生活水平不斷的提高，餐飲業(yè)在各個城市也迅速發(fā)展，餐飲廢水的排放量逐漸增大，由此而產(chǎn)生的含油脂污水特別是含高濃度油脂的污水量大幅度增長，已成為城市生活污水的重要組成部分。油類物質(zhì)進入水體，則漂浮于水體的表面，影響水體的復(fù)氧及其自然凈化過程，危害水體生態(tài)系統(tǒng)，又會引起水體的富營養(yǎng)化，威脅環(huán)境和人類健康。

目前處理餐飲廢水的方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法三種方法。與物理、化學(xué)法相比，微生物處理法具有經(jīng)濟、高效的優(yōu)點，并可以實現(xiàn)無害化、資源化，所以生物法在污水處理中長期以來占重要位置。

生物表面活性劑在污水的修復(fù)中有明顯的增效作用。和化學(xué)合成的表面活性劑先比具有以下優(yōu)越性：①生物表面活性劑具有一般化學(xué)合成的表面活性劑所不具有的獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生一些對修復(fù)有用的性質(zhì)。②生物表面活性劑是由微生物代謝產(chǎn)生的可生物降解的物質(zhì)。投放到被污染地區(qū)不會造成新的污染。③與化學(xué)合成的生物表面活性劑相比，生物表面活性劑的生產(chǎn)價格是可以接受的。④生物表面活性劑可以在污染地區(qū)及其附近生產(chǎn)得到，不需要運輸和儲存。本實驗主要通過合成生物表面活性劑鼠李糖脂，并將其加入校園含油污水中研究其對污水降解的增效作用。

2.實驗部分

2.1實驗材料與方法

2.1.1實驗材料

（1）實驗土樣：石油污染土樣取自油田油井附近地表深度為10cm左右的石油污染土壤。

（2）種子培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏2.0，蛋白胨5.0，NaCl5.0，瓊脂20.0，pH值7.0。

（3）種子培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3.0，蛋白胨5.0，NaCl5.0，pH值7.0。

（4）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：豆油50，NaNO3 8.0，KH2PO4 1.0，Na2HPO4?12H2O 1.0 ，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.2，PH值為7.0。

（5）苯酚溶液的配制：取5ml苯酚溶液放入到100ml容量瓶中，稀釋到刻度，得5%的苯酚溶液，將其置于冰箱中備用。

（6）鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取一定量鼠李糖溶于100ml容量瓶中，然后再配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2實驗儀器及試劑

2.2.1主要設(shè)備

超凈工作臺 JJT-7A

全自動高壓滅菌鍋 HVE-50

震蕩培養(yǎng)箱 QHZ-98A

高速臺式冷凍離心機 HFsafe1200

電子分析天平 BP211D型

2.2.2實驗試劑及儀器

無機鹽培養(yǎng)基（BR，上海化學(xué)試劑公司）、氯仿（AR，上海化學(xué)試劑公司），經(jīng)重蒸后使用。甲醇（AR，上海化學(xué)試劑公司）、苯酚（分析純重蒸餾試劑）、標(biāo)準(zhǔn)鼠李糖（國藥）、氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、濃硫酸（分析純）、去離子水、蒸餾水、分液漏斗、抽濾瓶、圓底燒瓶、直形冷凝管、蒸餾頭、錐形瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、移液管、吸耳球、藥勺、膠頭滴管、容量瓶、移液槍、稱量瓶。

2.3實驗步驟

2.3.1產(chǎn)表面活性劑菌的分離純化

取土樣2.5g，加200mL無機培鹽養(yǎng)基，在30℃，120r/min 的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)7d，移取一定量的富集培養(yǎng)液接入新鮮含油無機鹽培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)7d，共重復(fù)3次，在無菌的條件下，用接種環(huán)蘸取馴化培養(yǎng)液，在分離培養(yǎng)基的平板上劃線后，平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后將典型菌落在分離培養(yǎng)基的平板上反復(fù)劃線純化后得到單一菌落，再將純化的菌株接種至斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，4℃保存于冰箱中。

2.3.2鼠李糖脂的發(fā)酵培養(yǎng)及提取

配置發(fā)酵培養(yǎng)基，高壓滅菌后將A6 4%接入發(fā)酵培養(yǎng)72h，取發(fā)酵液在8000r/min，4℃下離心20min取出上清液，加6mol/L的HCL調(diào)節(jié)PH值至2.0，靜置過夜。用等體積氯仿/甲醇=2/1萃取，取下層有機相，64℃減壓蒸餾得到淺黃色漿狀物，既為表面活性劑的粗產(chǎn)物。

2.3.3鼠李糖脂的含量測定

將鼠李糖脂粗產(chǎn)物稀釋至0～80mg/l的范圍內(nèi)，用同樣的方法在480nm下測吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算鼠李糖脂的濃度。得到的鼠李糖脂的濃度（CRH）和鼠李糖濃度（CR）的倍比關(guān)系CRH=3.5CR，計算鼠李糖脂的濃度。

2.3.4鼠李糖脂產(chǎn)生條件的優(yōu)化

分別以葡萄糖、原油、甘油、豆油為唯一碳源，以NaNO3為氮源發(fā)酵培養(yǎng)，考察不同碳源條件下生物表面活性劑鼠李糖脂的產(chǎn)量情況。用同樣的方法研究以尿素，NH4Cl，（NH4）2SO4，NaNO3為唯一氮源，豆油為碳源時，生物表面活性劑鼠李糖脂的產(chǎn)量情況。確定最優(yōu)碳源和氮源。

2.3.5鼠李糖脂在污水修復(fù)中的應(yīng)用

（1）污水中油脂含量的測定

取50ml混合均勻的水樣，加入等體積的氯仿萃取，取出氯仿相。減壓蒸餾，將其中的氯仿蒸出。準(zhǔn)確稱量稱量瓶的重量，并將蒸餾后剩余的油脂用少量的氯仿溶解轉(zhuǎn)入稱量瓶中，放入水浴鍋中將其氯仿蒸發(fā)殆盡（多次稱量直至重量恒重），再準(zhǔn)確稱量稱量瓶和油脂的總重量，減量法得出稱量瓶中油脂的重量。

（2）鼠李糖脂在污水修復(fù)中的作用

取三組混合均勻的水樣各1L，給其中一組加900mg/l的鼠李糖脂，另一組加入同樣量的鼠李糖脂和降油菌，另一組做空白對照，分別測第5、10、15天時廢水中油脂的含量，觀察其變化情況

3.實驗結(jié)果與討論

3.1產(chǎn)表面活性劑菌株的分離和篩選

從油田油井附近所取的土壤樣品中，經(jīng)過平板分離篩選純化，得石油降解菌A6。A6菌為銅綠假單細(xì)胞菌， A6菌株形態(tài)特征和生理生化試驗指標(biāo)等實驗結(jié)果與假單胞菌屬的基本特征一致，所以以A6菌為實驗所用的菌。

3.2鼠李糖脂的發(fā)酵培養(yǎng)及提取

在發(fā)酵生產(chǎn)的鼠李糖脂過程中，發(fā)酵液在培養(yǎng)的第二天就發(fā)生了明顯的乳化現(xiàn)象，表明以豆油為碳源能夠誘導(dǎo)試驗菌種產(chǎn)生鼠李糖脂，從而促進菌種對豆油的攝入和利用。萃取過程中，出現(xiàn)界面明顯的分層，上層呈淺綠色，中層乳白絮狀混濁乳化層，下層為透明至白色有機溶液，取下層萃取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，減壓蒸餾得到棕黃色鼠李糖脂粗品。

3.3鼠李糖脂的含量測定

（1）鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用紫外分光光度法在480nm處測得鼠李糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1.1）的標(biāo)準(zhǔn)方程y=0.172x+0.0188――①，相關(guān)系數(shù)為0.9992，可見樣品中鼠李糖的濃度和吸光度之間的關(guān)系可以很好的用①式表示。

①式中：y――鼠李糖溶液的吸光度。

x――鼠李糖的濃度，單位mg/l。

（2）鼠李糖的含量測定

測得樣品的吸光度為1.501，將測得的吸光度值代入方程y=0.172x+0.0188中，得x=86.17，樣品中鼠李糖的濃度為86.17mg/l。根據(jù)鼠李糖脂的濃度（CRH）和鼠李糖的濃度（CR）的倍比關(guān)系CRH=3.5CR，計算出樣品種鼠李糖脂的含量為30.17%。

3.4鼠李糖脂產(chǎn)生條件的優(yōu)化

（1）碳源優(yōu)化

分別選用葡萄糖、原油、甘油、豆油為唯一碳源，NaNO3為氮源，發(fā)酵培養(yǎng)，所產(chǎn)生鼠李糖粗產(chǎn)物的干重如下圖：

由圖可以看出，甘油為碳源時產(chǎn)生的鼠李糖脂的量最多，而以豆油為碳源時產(chǎn)生的鼠李糖的量僅次于甘油為碳源時產(chǎn)生的鼠李糖脂量。

不同碳源產(chǎn)生樹立糖脂的量不同，碳源是構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和供給微生物生長發(fā)育所需要的能量，為細(xì)胞代謝產(chǎn)物中碳源開來源提供營養(yǎng)物質(zhì)，不同為生物對碳源的利用情況有差異，但大部分微生物以有機碳化合物為碳源和能源。碳源的分析結(jié)果顯示，甘油為碳源是鼠李糖脂的產(chǎn)量最為理想，甘油發(fā)酵中細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成具有相同的代謝途徑，所以鼠李糖脂的產(chǎn)量高。但是由于甘油成本較高，從經(jīng)濟方面考慮，豆油是大規(guī)模生產(chǎn)鼠李糖脂的首選碳源。

（2）氮源的優(yōu)化

分別以尿素，NH4Cl，（NH4）2SO4，NaNO3為唯一氮源，豆油為碳源，在相同培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)，測得鼠李糖脂粗產(chǎn)物的干重如下圖：

由上圖可以看出，以NaNO3為氮源時所產(chǎn)生的鼠李糖脂最多。氮源是合成生物表面活性劑鼠李糖脂的關(guān)鍵，它提供了合成原生質(zhì)和細(xì)胞其它結(jié)構(gòu)的原料，對微生物的生長發(fā)育和穩(wěn)定生長及細(xì)胞產(chǎn)生生物表面活性劑其重要作用。NaNO3在鼠李糖脂的合成中具有促進作用，NaNO3為合成鼠李糖脂最佳氮源。

3.5鼠李糖脂和降油菌聯(lián)合植物對污水的修復(fù)

（1）污水中油脂的含量

恒重法測得50ml混合均勻的水樣中油脂的含量為0.0227g，經(jīng)計算得出餐廳污水中油脂的含量為0.454g/l。

（2）鼠李糖脂在修復(fù)中的作用

分別測得鼠李糖脂及鼠李糖脂加降油菌對污水中油脂降解效果

由上圖可以看出，三組污水中油脂都降低了，并且降解時間越長降解率隨之增高。空白組中油脂的含量都有所降低。加入900mg/l的鼠李糖脂后油脂的含量和COD值有明顯的降低，降解率約增加10%，污水在鼠李糖脂和降油菌共同作用下降解效果最好。

污水有一定的自凈能力，水中的有機污染物在微生物的作用下進行氧化降解，逐漸被分解，最后變?yōu)闊o機物，是污水中有機污染物濃度降低。在污水中加入生物表面活性劑后，污水的降解率有明顯的增高，原因是鼠李糖脂可以增強污水中疏水化合物的生物可利用性和生物降解作用，主要通過增加疏水的不溶性基質(zhì)的表面積和增加疏水化合物的生物利用率來對污水進行修復(fù)。其次，鼠李糖脂的乳化作用可以使油脂液滴在水相中分散，并且增加兩相之間的界面面積，能增強憎水性物質(zhì)的親水性和生物可利用性，降低其表面張力，降解率增加。鼠李糖脂還可以增加細(xì)胞壁的疏水性，使油脂進入細(xì)胞內(nèi)從而被酶代謝，油脂在水中溶解度極低，鼠李糖脂可以促進疏水化合物的分散，增強疏水化合物的利用率。微生物是污水修復(fù)的主體，主要通過分泌胞外酶對有機污染物降解和吸收到細(xì)胞內(nèi)由胞內(nèi)酶對有機污染物降解，在污水中加入降油菌后，污水中微生物的種類和數(shù)量都有所增加，有機污染物會其被充分利用，降解率增高。

4、結(jié)論

本實驗主要研究了生物表面活性劑鼠李糖脂的發(fā)酵產(chǎn)生及提取方法，并對其產(chǎn)生條件進行了優(yōu)化，最后將其加入餐廳污水中研究在餐廳污水降解中的作用。實驗得出的主要結(jié)論有：

①可用發(fā)酵法發(fā)酵產(chǎn)生鼠李糖脂并用萃取法可將鼠李糖脂從發(fā)酵液中提出，減壓整蒸餾后可得到黃色膠狀物鼠李糖脂。

②碳、氮源的優(yōu)化結(jié)果表明，產(chǎn)生生物表面活性劑的首選培養(yǎng)基為（g/L）：豆油50，NaNO3 8.0，KH2PO4 1.0，Na2HPO4?12H2O 1.0 ，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.2，PH值為7.0。

③生物表活性劑主要通過增加疏水的不溶性基質(zhì)的表面積和增加疏水化合物的生物利用率來對含油進行修復(fù)。其次，鼠李糖脂的乳化作用可以使油脂液滴在水相中分散，并且增加兩相之間的界面面積，能增強憎水性物質(zhì)的親水性和生物可利用性，降低其表面張力，降解率增加。鼠李糖脂還可以增加細(xì)胞壁的疏水性，使油脂進入細(xì)胞內(nèi)從而被酶代謝，油脂在水中溶解度極低，鼠李糖脂可以促進疏水化合物的分散，增強疏水化合物的利用率。

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